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本文核心数据：酶的定向进化原理;高效构建突变体库的新方法;体外突变发;体内突变法;量定向进化的新方法
——酶的定向进化原理
酶的定向进化，旨在试管中模拟自然进化过程，通过提高基因突变率和设计特殊的筛选、选择方法，快速获得拥有特定性能的酶。因此，定向进化又被称为“代替自然选择的上帝之手”，为试管中的达尔文主义。酶的定向进化通常包括三个步骤：①通过对蛋白编码序列进行随机突变、定点突变或重组构建基因突变体库;②定向筛选、选择以获得具有改进表型的突变体;③以该突变体作为下一轮基因多样化的起点，进行定向进化的迭代，直到获得性能最优的突变体。
根据文库构建原理的不同，蛋白质定向进化可分为随机进化、半理性进化和理性进化三种策略，其大致思路均为由某一靶基因或一族相关的家族基因起始，通过对编码基因进行突变或重组，创建分子多样性文库;筛选文库获得能够编码改进性状的基因，作为下一轮进化的模板;在短时间内完成自然界中需要成千上万年的进化，从而获得具有改进功能或全新功能的蛋白质。
——高效构建突变体库的新方法
高效构建多样化的基因突变体库是定向进化的关键步骤之一。早期通过化学试剂(如甲磺酸乙酯、亚硝酸等)或射线对基因进行无差别随机突变的传统方法，由于突变率低并且极易造成基因组不稳定而逐渐被淘汰。取而代之的是一系列相对可控且有高突变率的体外突变法和体内突变法。
——体外突变法
体外突变法主要包括可以产生随机突变的易错PCR(error-prone PCR, epPCR)、DNA改组(DNA shuffling)、可以产生非随机突变的定点饱和突变(site-saturation mutagenesis, SSM)、序列饱和突变(sequence saturation mutagenesis, SeSaM)、合成文库(synthetic library generation)等，这些传统体外突变技术成为单个酶定向进化的有力工具，随着分子生物学的快速发展，构建体外突变体库的新方法也不断涌现。
此外，随着基因高通量合成技术及DNA测序技术的高速发展，传统的体外突变法存在的共有缺陷，如密码子缺乏控制、具有序列偏好性等，在一定程度上被合成文库法所改善。Twist Bioscience公司与M. Reetz课题组合作，在2018年报道了这种新型的体外突变体库构建方法，即在硅基芯片上应用大规模平行寡核苷酸合成技术，然后进行有效的基因组装，每种突变体均采用计算机模拟设计，并在合成前进行筛选，因此消除了不需要的序列偏倚、提前出现的终止密码子和多余的基序。通过实验分析，这种通过大规模基因合成构建突变体库的方法相比于利用传统的易错PCR或饱和突变等方法，具有野生型序列更少、突变体分布比例更均匀、文库多样性更丰富等突出优势，有利于下游筛选，目前，该方法已实现商业化应用。
